神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細胞和免疫細胞的細胞共培養(yǎng)步驟如下：

1將hPSC分化為星形膠質(zhì)細胞

1.按照STEMdiff™星形膠質(zhì)細胞分化和成熟試劑盒使用說明中概述的胚狀體（EB）或單層方案進行操作。

2.星形膠質(zhì)細胞成熟階段：星形膠質(zhì)細胞在STEMdiff™星形膠質(zhì)細胞成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少3周。

3.通過對培養(yǎng)的細胞亞群進行免疫細胞化學分析來驗證星形膠質(zhì)細胞分化是否成功。按照STEMdiff™星形膠質(zhì)細胞分化試劑盒使用說明，細胞群應大于70% S100?+、大于60% GFAP+和低于15% ?III-tubulin或雙皮質(zhì)素（DCX）陽性。

2 將hPSC分化為小膠質(zhì)細胞

1.按照STEMdiff™造血試劑盒使用說明中概述的方案生成造血祖細胞（HPC）。

2.過流式細胞術評估HPC分化效率。所得細胞群應大于90% CD43+ 和大于20% CD34/CD45共陽性。

3.按照STEMdiff™小膠質(zhì)細胞分化和成熟試劑盒使用說明的A部分（小膠質(zhì)細胞分化）中概述的步驟1-8進行操作。

4.通過流式細胞術評估小膠質(zhì)細胞分化的效率。所得細胞群應超過80%為CD45和CD11b共陽性。

5.可選步驟：在第五部分的共培養(yǎng)之前，可以使用STEMdiff™小膠質(zhì)細胞成熟試劑盒進一步培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞，但小膠質(zhì)細胞分化后的額外培養(yǎng)總時間不得超過10天（成熟期和共培養(yǎng)期的總和）。

3將hPSC分化為前腦神經(jīng)元

1.根據(jù)STEMdiff™前腦神經(jīng)元分化和成熟試劑盒使用說明中概述的胚狀體（EB）或單層方案進行操作。

注：將神經(jīng)元前體細胞接種到STEMdiff™前腦神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基中（使用說明C部分第1步）時，星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的建議密度范圍為1.5 x 104 - 4 x 104細胞/cm2。最佳密度根據(jù)實際情況相應調(diào)整。

2.前腦神經(jīng)元成熟階段：神經(jīng)元在STEMdiff™前腦神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少7天。

3.通過對培養(yǎng)的細胞亞群進行免疫細胞化學分析來驗證前腦神經(jīng)元分化是否成功。所得細胞群?III-tubulin和FOXG1的陽性率應大于90%，星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的陽性率應低于10%。

4建立前腦神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)

1.按照STEMdiff™星形膠質(zhì)細胞試劑盒的使用說明的C部分（星形膠質(zhì)細胞成熟）的步驟1-5從第一部分中分離成熟的星形膠質(zhì)細胞。

注：將細胞重新懸浮在1 mL STEMdiff™星形膠質(zhì)細胞成熟培養(yǎng)基中，然后使用臺盼藍和血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。

2.在STEMdiff™星形膠質(zhì)細胞成熟培養(yǎng)基中稀釋細胞懸浮液，以獲得所需的細胞濃度和體積。

注：星形膠質(zhì)細胞懸浮液的濃度和體積應自行優(yōu)化，并取決于所需的星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的細胞類型比率、使用的培養(yǎng)孔數(shù)量以及第三部分第1步中接種的前腦神經(jīng)元前體的初始細胞密度。推薦進行共培養(yǎng)時星形膠質(zhì)細胞與前腦神經(jīng)元的比率為1:1。

3.取出并棄去第三部分中前腦神經(jīng)元生成的培養(yǎng)基。

4.將步驟2中制備的懸浮星形膠質(zhì)細胞接種到前腦神經(jīng)元上，并在STEMdiff™星形膠質(zhì)細胞成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。繼續(xù)第五部分。

5建立共培養(yǎng)體系

1.在BrainPhys™的使用說明中，按照“分化培養(yǎng)基的制備"（B部分）的說明制備所需體積的BrainPhys™神經(jīng)元培養(yǎng)基和添加物。

注：所需培養(yǎng)基的量取決于培養(yǎng)板的形式和所需的共培養(yǎng)的周期。

2.將STEMdiff™小膠質(zhì)細胞添加物2在室溫下解凍或者在2-8°C下過夜。充分混合。

注：如果不立即使用，請分裝并儲存在-20°C下。請勿超過標簽上標明的有效期 (EXP)。另外，該組分可單獨購買。

3.按照以下步驟制備優(yōu)化的共培養(yǎng)基：

a. 將STEMdiff™小膠質(zhì)細胞添加物2添加到BrainPhys™神經(jīng)元培養(yǎng)基和添加物中，直至最終濃度為1X（如每10 mL培養(yǎng)基添加40 µL添加物）。

b. 充分混合。

注：如果不立即使用，培養(yǎng)基存放在2-8°C下最多2周。

4.從第二部分收集小膠質(zhì)細胞：

a. 將整個細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中。為收集盡可能多的細胞，可以使用含有15 mM HEPES的溫熱DMEM/F-12進行清洗。

b . 以 300 x g轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

c . 去除上清液，并將沉淀物重新懸浮在適當體積的共培養(yǎng)基中。

d . 使用臺盼藍和血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞。

5.在新的共培養(yǎng)基中稀釋小膠質(zhì)細胞懸浮液，以獲得所需的最終細胞濃度和體積。

6.取出并丟棄第四部分中產(chǎn)生的前腦神經(jīng)元 - 星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。

7.將重新懸浮的小膠質(zhì)細胞接種到共培養(yǎng)的前腦神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞上。

8.將培養(yǎng)板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中。通過快速、短暫地前后和左右移動培養(yǎng)板，使細胞分布均勻。

9.每2-3天使用共培養(yǎng)基進行半換液。

注：小膠質(zhì)細胞是半粘附的，在更換培養(yǎng)基時可能會被移除。在進行半換液之前，將板放入帶有板適配器的吊桶式離心機中，以100 x g的速度離心2分鐘，使細胞沉降。

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