細胞計數是確定培養中鋪板的細胞濃度、確定細胞活力和評估細胞分離程序結果的一個組成部分。建議在細胞分離之前進行初始細胞計數；然后可以將該數字與細胞分離后的細胞計數進行比較，以計算細胞恢復率。此外，當預期細胞活力可能會降低時，應進行活細胞計數，例如，在處理冷凍保存的細胞或離體操作的細胞時。

    可以使用臺盼藍或3% 乙酸和亞甲藍進行細胞計數. 進行總有核細胞計數時，建議使用 3% 乙酸和亞-CH3藍。乙酸溶解細胞膜，亞甲藍染色暴露的細胞核。由于成熟的紅細胞缺乏細胞核，因此在計數時被排除在外。或者，建議使用臺盼藍來計數活的哺乳動物細胞。臺盼藍穿透細胞膜，因此它進入細胞膜受損的細胞（死細胞）的細胞質，將它們染成藍色。活細胞保持完整，可以通過排除藍色染料的能力與死細胞區分開來。在這種情況下，人們將計算完整的活細胞。

   本文描述了如何使用 3% 乙酸和亞-CH3藍進行總有核細胞計數，以及如何通過臺盼藍染料排除進行活細胞計數。

材料準備：

3% 乙酸和亞-CH3藍（或臺盼藍

96 孔板（例如 Corning® 96 孔圓底微孔板，貨號 #38018）或微量離心管（例如 Costar® 微量離心管，貨號#38090）

血細胞計數器（血細胞計數板）和蓋玻片

70% C2H6O

移液器（例如瑞寧移液器）

實驗步驟和方法：

第一部分：樣品制備

選項 1：用 3% 乙酸和亞-CH3藍對總有核細胞計數進行細胞稀釋

  使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養基對充分混合的單細胞懸浮液進行適當稀釋。為了準確表示濃度，請使用至少 20 μL 的細胞懸浮液進行稀釋。

示例：制備 10 倍稀釋液

在微量離心管或 96 孔板的孔中加入 180 μL 的 3% 乙酸和亞-CH3藍。混合細胞懸浮液，將 20 μL 添加到含有 3% 乙酸和亞-CH3藍的試管或孔中。

選項 2：通過臺盼藍染料排除對活細胞計數進行細胞稀釋

 確保要計數的細胞懸浮液*重新懸浮。在細胞沉降之前，將適量的細胞懸液 (20-200 μL) 放入離心管中。加入等體積的 0.4% 臺盼藍并輕輕混合。將混合物在室溫 (15°C – 25°C) 下孵育 5 分鐘。

第二部分：使用血細胞計數器進行細胞計數

   通過用 70% C2H6O清潔腔室表面來制備血細胞計數器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。

 使用 20 μL 移液器重新懸浮細胞混合物，并將 10 μL 的染色細胞放入血細胞計室。

注意：小心不要移動蓋玻片。允許毛細作用將樣品吸入。

 將血細胞計數器放在雙目光學顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調整到 10 倍放大倍率并聚焦在細胞上。

 使用手動計數計數器，計算血細胞計數器四個外部正方形中的每一個中的細胞（染色的細胞核）（圖 1A），包括位于底部和左側周邊的細胞，但不包括位于頂部和右手邊（圖 1B）。如果在第一部分中使用了 3% 乙酸和亞-CH3藍，則計算染色的細胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍，則計算未染色的活細胞。

圖 1.血細胞計數器網格線

血細胞計數器圖指示（A）四組紅色和（B）其中一組應用于計數的 16 個方塊。

注意： 適當的稀釋系數將取決于起始樣本中存在的大致細胞數量，但應使血細胞計數器中的細胞濃度為每平方（即大或主要正方形）50-100 個細胞。如果血細胞計數器上每個主要正方形的細胞多于或少于大約 100 個，請使用更大或更小的稀釋因子制備新的稀釋樣品。

     血細胞計數器的九個主要方塊中的每一個都代表 0.1 mm 3的總體積。由于 1 cm 3相當于 1 mL，因此可以使用以下等式確定細胞濃度：

有核細胞總數/mL = 每平方平均細胞數 x 稀釋因子 x 10 4

示例：如果四個外部方塊中的每一個的細胞計數在 100 稀釋因子下分別為 21、15、20 和 17，則平均細胞計數將為 (21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18.25。

因此，原始懸浮液中細胞的總濃度為：18.25 x 100 x 10^4 = 18,250,000 個細胞/mL。

使用人工的細胞計數方法誤差率較高，為提高細胞計數的準確度和細胞計數效率可以使用全自動細胞計數儀進行細胞計數。博大博聚旗下的全自動細胞細胞計數儀系列，具有多種規格供選擇，可以滿足不同的用戶需求。

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